免疫組化實驗注意事項

1. 蘇木素復染時間需要摸索，尤其陽性染色也在細胞核上。

2. DAB顯色時間需要達到*化，鏡下觀察達到陽性染色明顯但背景不太深。

3. 抗體孵育時間和抗體濃度需要摸索。尤其一抗孵育溫度在4度。

4. 切片脫蠟和水化要充分；加反應(yīng)液時要覆蓋組織充分；每次加液前甩干洗滌液，但又防止干片；用組化筆畫圈時盡量畫大一點，否則墨水排斥液體，引起片周邊干片。

5. 片子著色不均勻的原因如下：

（1） 脫蠟不充分。可以60 ℃烤20 min，立即放入新鮮的xylene1；

（2）水化不全。應(yīng)經(jīng)常配制新鮮的梯度乙醇；

（3）抗體沒混勻。用移液器充分混勻一抗/二抗等試劑；

（4） 抗體孵育時，切片放傾斜；

（5）抗體孵育后PBS沖洗不充分。

（6） 制片厚薄不均勻等問題。染片盒不平，切片傾斜。

6. 一抗從4 ℃拿出后，為什么有人說要37度復溫，目的是什么？

（1） 一方面，防止切片從4 ℃直接放入PBS易脫片；

（2）另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要,但對表達較弱的抗原可能有用,4 ℃和37 ℃度時分子運動方式不同,前者分子碰撞機率和運動速度小于后者,后者結(jié)合更快,但敏感性也提高了并易造成非特異染色。

7. 切片染色后背景太深，不易區(qū)分特異性與非特異性著色？

（1） 抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制；

（2） 一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看；

（3）內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高，需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；

（4）非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果；

（5） DAB顯色時間過長或濃度過高；

（6） PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強著色；

（7） 標本染色過程中出現(xiàn)干片，易增強非特異性著色。