技術文章
凝膠遷移實驗點擊次數：4764 更新時間：2012-05-29
凝膠遷移實驗
凝膠遷移實驗中,全面詳細地介紹具體的實驗操作方法,從探針的標記,探針的純化,EMSA膠的配制,EMSA結合反應,再到zui后的電泳分析. www.biomart.cn/runwell/index.htm
1.探針的標記
（1） 如下設置探針標記的反應體系：
待標記探針 （1.75pmol/微升） 2微升
T4 Polynucleotide Kinase Buffer （10X） 1微升
Nuclease-Free Water 5微升
[γ-32P]ATP（3,000Ci/mmol at 10mCi/ml） 1微升
T4 Polynucleotide Kinase （5-10U/微升） 1微升
總體積 10微升
按照上述反應體系依次加入各種試劑,加入同位素后,Vortex混勻,再加入T4 Polynucleotide Kinase,混勻.
（2） 使用水浴或PCR儀,37℃反應10分鐘.
（3） 加入1微升探針標記終止液,混勻,終止探針標記反應.
（4） 再加入89微升TE,混勻.此時可以取少量探針用于檢測標記的效率.通常標記的效率在30%以上,即總放射性的30%以上標 記到了探針上.為實驗簡便起見,通常不必測定探針的標記效率.
（5） 標記好的探針立即使用,zui長使用時間一般不宜超過3天.標記好的探針可以保存在-20℃.
2.探針的純化
通常為實驗簡便起見,可以不必純化標記好的探針.在有些時候,純化后的探針會改善EMSA的電泳結果.如需純化,可以按照如 下步驟操作：
（1） 對于100微升標記好的探針,加入1/4體積即25微升的5M醋酸銨,再加入2體積即200微升的無水乙醇,混勻.
（2） 在-70℃至-80℃沉淀1小時,或在-20℃沉淀過夜.
（3） 在4℃,12000g-16000g離心30分鐘.小心去除上清,切不可觸及沉.
（4） 在4℃,12000g-16000g離心1分鐘.小心吸去殘余液體.微晾干沉淀,但不宜過分干燥.
（5） 加入100微升TE,*溶解沉淀.標記好的探針立即使用,zui長使用時間一般不宜超過3天.標記好的探針可以保存于-20℃.
3.EMSA膠的配制
（1） 準備好倒膠的模具.可以使用常規的灌制蛋白電泳膠的模具,或其它適當的模具.選擇可以灌制較薄膠的模具,以便于干膠等后續操作.為得到更好的結果,可以選擇可灌制較大 EMSA 膠的模具.
（2） 按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝膠（注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對結果影響不大）.
TBE buffer （10X） 1毫升
重蒸水 16.2毫升
39:1 acrylamide/bisacrylamide （40%,w/v） 2毫升
80% 甘油 625微升
10% 過硫酸銨 （ammonium persulfate） 150微升
TEMED 10微升
（3） 按照上述次序加入各個溶液,加入TEMED前先混勻,加入TEMED后立即混勻,并馬上加入到制膠的模具中.避免產生氣泡, 并加上梳齒.如果發現非常容易形成氣泡,可以把一塊制膠的玻璃板進行硅烷化處理.
4.EMSA結合反應www.rose-nail.cn
（1） 如下設置EMSA結合反應：
陰性對照反應：
Nuclease-Free Water 7微升
EMSA/Gel-Shift結合緩沖液（5X） 2微升
細胞核蛋白或純化的轉錄因子 0微升
標記好的探針 1微升
總體積 10微升
樣品反應：
Nuclease-Free Water 5微升
EMSA/Gel-Shift結合緩沖液（5X） 2微升
細胞核蛋白或純化的轉錄因子 2微升
標記好的探針 1微升
總體積 10微升
探針冷競爭反應：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift結合緩沖液（5X） 2微升
細胞核蛋白或純化的轉錄因子 2微升
未標記的探針 1微升
標記好的探針 1微升
總體積 10微升
突變探針的冷競爭反應：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift結合緩沖液（5X） 2微升
細胞核蛋白或純化的轉錄因子 2微升
未標記的突變探針 1微升
標記好的探針 1微升
總體積 10微升
Super-shift反應：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift結合緩沖液（5X） 2微升
細胞核蛋白或純化的轉錄因子 2微升
目的蛋白特異抗體 1微升
標記好的探針 1微升
總體積 10微升
（2） 按照上述順序依次加入各種試劑 ,在加入標記好的探針前先混勻,并且室溫（20-25℃）放置10分鐘,從而消除可能發生的探針和蛋白的非特異性結合,或者讓冷探針優先反應.然后加入標記好的探針,混勻,室溫（20-25℃）放置20分鐘.
（3） 加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液（無色,10X）,混勻后立即上樣.注意：有些時候溴酚藍會影響蛋白和DNA的結合,建 議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液.如果對于使用無色上樣緩沖液在上樣時感覺到無法上樣,可以在無色上樣緩沖液里面添加極少量的藍色的上樣緩沖液,至能觀察到藍顏色即可.
5. 電泳分析
（1） 用0.5XTBE作為電泳液.按照10V/厘米的電壓預電泳10分鐘.預電泳的時候如果有空余的上樣孔,可以加入少量稀釋好的1X 的EMSA上樣緩沖液（藍色）,以觀察電壓是否正常進行.
（2） 把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內.在多余的某個上樣孔內加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液（藍色）,用于觀察電泳進行的情況.
（3） 按照10V/厘米的電壓電泳.確保膠的溫度不超過30℃,如果溫度升高,需要適當降低電壓.電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩 沖液中的藍色染料溴酚藍至膠的下緣1/4處,停止電泳.
（4） 剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實的濾紙.小心取下夾有EMSA膠的膠板,用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊緣的電壓液.小心打開兩塊膠板中的上面一塊（注：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板）,把濾紙從EMSA膠的一側逐漸覆蓋住整個EMSA膠,輕輕把濾紙和膠壓緊.濾紙被膠微微浸濕后（大約不足1分鐘）,輕輕揭起濾紙,這時EMSA膠會被濾紙一起揭起來.把濾紙側向下,放平,在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜,確保保鮮膜和膠之間沒有氣泡.
（5） 干膠儀器上干燥EMSA膠.然后用X光片壓片檢測,或用其它適當儀器設備檢測.
（1） 如下設置探針標記的反應體系：
待標記探針 （1.75pmol/微升） 2微升
T4 Polynucleotide Kinase Buffer （10X） 1微升
Nuclease-Free Water 5微升
[γ-32P]ATP（3,000Ci/mmol at 10mCi/ml） 1微升
T4 Polynucleotide Kinase （5-10U/微升） 1微升
總體積 10微升
按照上述反應體系依次加入各種試劑,加入同位素后,Vortex混勻,再加入T4 Polynucleotide Kinase,混勻.
（2） 使用水浴或PCR儀,37℃反應10分鐘.
（3） 加入1微升探針標記終止液,混勻,終止探針標記反應.
（4） 再加入89微升TE,混勻.此時可以取少量探針用于檢測標記的效率.通常標記的效率在30%以上,即總放射性的30%以上標 記到了探針上.為實驗簡便起見,通常不必測定探針的標記效率.
（5） 標記好的探針立即使用,zui長使用時間一般不宜超過3天.標記好的探針可以保存在-20℃.
2.探針的純化
通常為實驗簡便起見,可以不必純化標記好的探針.在有些時候,純化后的探針會改善EMSA的電泳結果.如需純化,可以按照如 下步驟操作：
（1） 對于100微升標記好的探針,加入1/4體積即25微升的5M醋酸銨,再加入2體積即200微升的無水乙醇,混勻.
（2） 在-70℃至-80℃沉淀1小時,或在-20℃沉淀過夜.
（3） 在4℃,12000g-16000g離心30分鐘.小心去除上清,切不可觸及沉.
（4） 在4℃,12000g-16000g離心1分鐘.小心吸去殘余液體.微晾干沉淀,但不宜過分干燥.
（5） 加入100微升TE,*溶解沉淀.標記好的探針立即使用,zui長使用時間一般不宜超過3天.標記好的探針可以保存于-20℃.
3.EMSA膠的配制
（1） 準備好倒膠的模具.可以使用常規的灌制蛋白電泳膠的模具,或其它適當的模具.選擇可以灌制較薄膠的模具,以便于干膠等后續操作.為得到更好的結果,可以選擇可灌制較大 EMSA 膠的模具.
（2） 按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝膠（注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對結果影響不大）.
TBE buffer （10X） 1毫升
重蒸水 16.2毫升
39:1 acrylamide/bisacrylamide （40%,w/v） 2毫升
80% 甘油 625微升
10% 過硫酸銨 （ammonium persulfate） 150微升
TEMED 10微升
（3） 按照上述次序加入各個溶液,加入TEMED前先混勻,加入TEMED后立即混勻,并馬上加入到制膠的模具中.避免產生氣泡, 并加上梳齒.如果發現非常容易形成氣泡,可以把一塊制膠的玻璃板進行硅烷化處理.
4.EMSA結合反應www.rose-nail.cn
（1） 如下設置EMSA結合反應：
陰性對照反應：
Nuclease-Free Water 7微升
EMSA/Gel-Shift結合緩沖液（5X） 2微升
細胞核蛋白或純化的轉錄因子 0微升
標記好的探針 1微升
總體積 10微升
樣品反應：
Nuclease-Free Water 5微升
EMSA/Gel-Shift結合緩沖液（5X） 2微升
細胞核蛋白或純化的轉錄因子 2微升
標記好的探針 1微升
總體積 10微升
探針冷競爭反應：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift結合緩沖液（5X） 2微升
細胞核蛋白或純化的轉錄因子 2微升
未標記的探針 1微升
標記好的探針 1微升
總體積 10微升
突變探針的冷競爭反應：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift結合緩沖液（5X） 2微升
細胞核蛋白或純化的轉錄因子 2微升
未標記的突變探針 1微升
標記好的探針 1微升
總體積 10微升
Super-shift反應：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift結合緩沖液（5X） 2微升
細胞核蛋白或純化的轉錄因子 2微升
目的蛋白特異抗體 1微升
標記好的探針 1微升
總體積 10微升
（2） 按照上述順序依次加入各種試劑 ,在加入標記好的探針前先混勻,并且室溫（20-25℃）放置10分鐘,從而消除可能發生的探針和蛋白的非特異性結合,或者讓冷探針優先反應.然后加入標記好的探針,混勻,室溫（20-25℃）放置20分鐘.
（3） 加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液（無色,10X）,混勻后立即上樣.注意：有些時候溴酚藍會影響蛋白和DNA的結合,建 議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液.如果對于使用無色上樣緩沖液在上樣時感覺到無法上樣,可以在無色上樣緩沖液里面添加極少量的藍色的上樣緩沖液,至能觀察到藍顏色即可.
5. 電泳分析
（1） 用0.5XTBE作為電泳液.按照10V/厘米的電壓預電泳10分鐘.預電泳的時候如果有空余的上樣孔,可以加入少量稀釋好的1X 的EMSA上樣緩沖液（藍色）,以觀察電壓是否正常進行.
（2） 把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內.在多余的某個上樣孔內加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液（藍色）,用于觀察電泳進行的情況.
（3） 按照10V/厘米的電壓電泳.確保膠的溫度不超過30℃,如果溫度升高,需要適當降低電壓.電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩 沖液中的藍色染料溴酚藍至膠的下緣1/4處,停止電泳.
（4） 剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實的濾紙.小心取下夾有EMSA膠的膠板,用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊緣的電壓液.小心打開兩塊膠板中的上面一塊（注：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板）,把濾紙從EMSA膠的一側逐漸覆蓋住整個EMSA膠,輕輕把濾紙和膠壓緊.濾紙被膠微微浸濕后（大約不足1分鐘）,輕輕揭起濾紙,這時EMSA膠會被濾紙一起揭起來.把濾紙側向下,放平,在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜,確保保鮮膜和膠之間沒有氣泡.
（5） 干膠儀器上干燥EMSA膠.然后用X光片壓片檢測,或用其它適當儀器設備檢測.
|
|||||
|
|||||
 |
